Er zijn veel werkgebieden waar het identificeren van een specifiek molecuul het verschil kan maken. Denk bijvoorbeeld aan onderzoek naar vervuiling van oppervlaktewater. Als er veel stoffen in het water zitten die er niet in thuis horen, dan wil je exact weten welke stoffen dit zijn. Maar er zijn ook andere toepassingen denkbaar.
Opsporen stofwisselingsziekten
Zo is ook in de gezondheidszorg het identificeren van moleculen heel belangrijk, bijvoorbeeld voor het vroegtijdig kunnen opsporen van erfelijke ziektes. In het Radboudumc in Nijmegen doen ze veel onderzoek naar stofwisselingsziekten. Er is ontdekt dat er bij mensen met deze ziekten specifieke moleculen in het bloed zitten, die gezonde mensen niet hebben. Als je deze moleculen kunt opsporen in het bloed dat je afneemt bij de hielprik van pasgeboren baby’s, dan kun je al vlak na de geboorte vaststellen dat een kind aan een stofwisselingsziekte lijdt. Hierdoor kunnen artsen meteen starten met verder onderzoek en met de behandeling van de baby. Bij het onderzoeken van de verschillende soorten moleculen die voorkomen bij mensen met stofwisselingsziekten, spelen de vrije-elektronenlasers van FELIX een cruciale rol. Specifieke moleculen kunnen met behulp van deze vrij-elektronenlasers worden opgespoord en geïdentificeerd.
Verschillende molecuulstructuren
Natuurlijk bestaan er al tal van technieken waarbij bepaalde moleculen opgespoord kunnen worden. Vaak loop je hierbij echter tegen een probleem aan. Je weet bijvoorbeeld wel hoe zwaar een molecuul is en uit welke atomen dit bestaat, maar wat je niet weet, is hoe deze atomen aan elkaar vastzitten. Bij een molecuul met de molecuulformule C8H8O4 kunnen de atomen bijvoorbeeld op veel verschillende manieren aan elkaar vastzitten.
Hoe kun je nu achterhalen met welke van deze molecuulstructuren je te maken hebt? Hiervoor heb je een gevoelige methode nodig, die het onderscheid tussen de verschillende moleculen zichtbaar maakt. In Nijmegen hebben ze hier een nieuwe techniek voor ontwikkeld, door een massaspectrometer – een apparaat dat erg gevoelig moleculen kan scheiden en wegen – te koppelen aan een vrije-elektronenlaserbundel. Hiermee kunnen onderzoekers een infrarood-‘vingerafdruk’ van een molecuul meten, waarmee ze de molecuulstructuur kunnen achterhalen. Zo weten ze exact om welk molecuul het gaat.
Moleculen identificeren
Rianne van Outersterp werkt als promovendus bij het FELIX Laboratory in Nijmegen. Zij doet onderzoek met deze methode en werkt veel samen met het Radboudumc in Nijmegen. “Er zijn nu 18 stofwisselingsziekten die ze kunnen opsporen met de hielprik, maar er zijn er nog veel meer, wel honderden. Daarom proberen we de afwijkende moleculen te identificeren in het bloed van patiënten met verschillende stofwisselingsziekten. Als ze in het ziekenhuis bij metingen aan het bloed (of de urine) van patiënten moleculen vinden met een afwijkende concentratie, dan weten ze nog niet om welk molecuul of stofwisselingsziekte het precies gaat. Wij kunnen dan bij FELIX precies voor hen uitzoeken met welk molecuul ze te maken hebben. Artsen kunnen met deze informatie dan verder uitzoeken wat er misgaat in de stofwisseling en mogelijk medicatie toepassen.”
Scheiden moleculen
Rianne van Outersterp is betrokken bij het hele meetproces. Ze gaat zelf naar het ziekenhuis om hier een afgenomen bloedmonster te bewerken, zodat het gebruikt kan worden in de apparatuur bij FELIX. Hierna moeten de moleculen uit het bloed (of de urine) waaraan ze wil meten, gescheiden worden van de rest van de moleculen in het bloed. Dit gebeurt in het FELIX Laboratory met de chemische scheidingsmethode vloeistof-chromatografie. In een kolom zit een bepaalde vulling (packing). Hier sturen ze het bloed samen met een andere vloeistof doorheen onder hoge druk. De moleculen die graag plakken aan de moleculen van de vulling gaan er langzaam doorheen, de moleculen die graag oplossen in de vloeistof en niet graag plakken gaan sneller. Door nu op het juiste moment de uitstromende vloeistof af te tappen – dit moment bepalen ze door van tevoren een kalibratiemeting uit te voeren – krijg je een monster met daarin de moleculen die je wilt onderzoeken. Zo scheiden ze de moleculen die ze verder willen onderzoeken (of identificeren) van de overige moleculen.
Molecuulmassa meten
In het FELIX Laboratory staat een meetopstelling met een massaspectrometer. Hierin is een opening gemaakt, zodat een laserbundel afkomstig van de vrije-elektronenlaser ingekoppeld kan worden in het monster dat in de massaspectrometer zit. Als je alleen de massaspectrometer zou gebruiken, dan meet de massaspectrometer wat de massa is van de moleculen in het monster. Behalve de massa’s meten van de moleculen in je monster, kun je ook één bepaald molecuul met een specifieke massa isoleren en vasthouden, zodat je dit rustig met het licht van een vrije-elektronenlaser kunt beschijnen. De massaspectrometer is dan een additionele scheidingstechniek en de vrije-elektronenlaser de identificatie-techniek.
Absorptie infraroodlaserlicht
Laat je nu de vrije-elektronenlaserbundel – bij verschillende golflengtes – schijnen op de moleculen die je geïsoleerd hebt in de massaspectrometer, dan wordt bij bepaalde golflengtes in het infraroodspectrum het laserlicht geabsorbeerd door het molecuul. Bij welke golflengtes dit gebeurt, is afhankelijk van de bindingen tussen de atomen waaruit het molecuul is opgebouwd. Door deze absorptie krijgt het molecuul meer energie en gaan de atomen in het molecuul harder trillen, totdat ze zo hard trillen dat de zwakste bindingen losspringen en het molecuul uit elkaar valt. Hierdoor zitten er in het monster in de massaspectrometer niet meer alleen moleculen met een molecuulgewicht van bijvoorbeeld 167, maar kunnen er ook moleculen met een molecuulgewicht van 123 in zitten. Met de massaspectrometer meet je dan een piek voor beide molecuulgewichten.
Fragmentatie
Het uit elkaar vallen van de moleculen in moleculen met een lagere molecuulmassa noem je fragmentatie. Je kunt je voorstellen dat bij elke golflengte waarbij absorptie plaatsvindt, de moleculen een andere hoeveelheid energie opnemen. Hoe meer energie opgenomen wordt, hoe harder de moleculen gaan trillen en hoe meer bindingen er losspringen. Bij iedere golflengte kun je zo de verhouding bepalen tussen de heel gebleven moleculen en de uit elkaar gevallen moleculen. Dit noem je de fragmentatieopbrengst.
Infraroodspectrum maken
“Het mooie is dat we met de vrije-elektronenlaser bij een groot aantal verschillende golflengten in het infraroodgebied kunnen meten. Door de afstand tussen de rijen magneten in de vrije-elektronenlaser steeds een beetje te veranderen kunnen we bij verschillende golflengten meten wat er gebeurt met de moleculen. Bij elke golflengte meten we de fragmentatieopbrengst. In een grafiek zetten we deze fragmentatieopbrengst vervolgens uit tegen de golflengte. Zo kun je dan een infraroodspectrum van het molecuul maken,” legt Rianne van Outersterp uit. “Je ziet dan bij elke golflengte van het laserlicht of het molecuul uit elkaar valt en in welke mate. Het spectrum dat zo ontstaat, is voor elk molecuul weer anders. Zo kun je heel goed moleculen die maar heel weinig van elkaar verschillen onderscheiden.”
Referentie spectrum
Rianne van Outersterp: “Als je wilt bepalen met welk molecuul je te maken hebt, moet je wel een referentie hebben. Als je bijvoorbeeld drie mogelijke molecuulstructuren hebt, dan moet je van alle drie de moleculen het infraroodspectrum hebben om dit te kunnen vergelijken met het onbekende molecuul. In veel gevallen zijn de moleculen die je als referentie wilt gebruiken gewoon te koop, maar soms moeten we de moleculen laten maken. Dat is vaak een langdurig proces, het kan maanden duren voordat je zo’n molecuul dan hebt.”
Simuleren infraroodspectrum
Het voordeel van infraroodspectroscopie ten opzichte van andere analytische technieken is dat je infraroodspectra ook kunt berekenen op basis van de quantum-mechanica. “We maken de moleculen die het kunnen zijn dan op de computer na met een simulatieprogramma,” vertelt Rianne van Outersterp. “Daarna berekenen we op basis van de quantum-mechanische wetten wat het spectrum van dit molecuul zou moeten zijn. Dit zijn enorme berekeningen, die we uitvoeren met supercomputers. Uiteindelijk hebben we drie infraroodspectra waarmee we het gemeten spectrum van ons onbekende molecuul kunnen vergelijken. Zo kunnen we bepalen met welk molecuul we te maken hebben.”
